DNA- und Protein-Chips:
die langsame Revolution

• langsame Revolution:
• Technik seit fast 10 Jahren bekannt
• man ging anfangs von Revolution aus
• aber: dem war nicht so (oder eben nur sehr langsam)
• Weswegen brauchen wir Chiptechnologie, was ist der Nutzen?
• nur parallele Analyse vieler/aller Gene | Proteine kann zur Entschlüsselung des Tumorgeschehens führen
• Negativ-Beispiel:
• Tumor-Suppressor-Gen p53
• wurde anfangs hoch gehandelt
• hat sich nicht bewährt
• was wird nachgewiesen?
• DNA
• SNP
• Nachweis von Mutationen
• siehe
• SNP
• single nucleotide polymorphism
• häufigste Variation zwischen Individuen
• einzelne Positionen in Genom können jede beliebige Base sein
• an einer Position der DNA kann entweder A,C,G oder T stehen
• Frequenz mindestens 1/1000 (intragenisch 1/2000, extragenisch 1/500)
• sehr Interessant für
• direkte Diagnose von Krankheiten
• Medikamentenunverträglichkeiten
• ® Versicherungen ??
• Thema: gläserner Mensch
• CGH
• Nachweis von Deletion oder Zugewinn
• relativ gut erforscht
• ® in der Forschung nicht mehr soooooo aktuell
• RNA
• cDNA
  DNA
• Expression auf RNA-Ebene wird gemessen
• Protein
• ProteinChip
• Expression auf Protein-Ebene
• ELISA-Typ
• Expression auf Protein-Ebene
• TMA
• Expression auf Protein-Ebene
• DNA-Arrays
• siehe
• Microarrays (DNA-Chips)
• Gene Chips / DNA-Microarrays
• sind Glasträger auf den kurze DNA-Sequenzen punktgenau und in hoher Dichte aufgebracht werden
• Matrix mit vielen spezifischen Indikatoren für verschiedene Gene
• damit möglich: Expression aller Gene eines Organismus auf einmal testen
• Arbeitsweise
• dazu: auf dem Glasträger sind sogenannte Probes gebunden
• cDNA/Oligo
• Rmit bekannter Sequenz
• dann wird Target-DNA aufgebracht
• fluoreszenzmarkiert
• DNA
• mRNA ® cDNA
• Bindung von Sequenzen nur da, wo komplementäre Sequenzen
• dann Readout
• durch Scanner
• Ergebnis: Mutationsnachweis durch Messen der Fluoreszenzmessung
• Anwendungsgebiete
• Identifikation von Sequenzen
• Genmutation
• SNP
• Nachweis der Höhe der Genexpression
• Funktionsweise: Expressionsanalyse
• verschiedenfarbige Markierung von cDNAs von Tumoren und gesunden Zellen
• z.B. grün für gesund
• rot für Tumor
• dann Anwendung auf Microarray
• Rot ®Gen im Tumor hoch exprimiert
• Grün ®Gen im Normalgewebe hoch exprimiert
• Mischfarbe ® hohe Expression sowohl im Tumor als auch im Normalgewebe
• Protein-Arrays
• Proteom
• Proteomics
• strukturelle Analyse
• = Information
• funktionelle Analyse
• = Verständnis
• das Problem mit dem Proteom
• Gen A ® Protein 1
  Gen A ® Protein 2
  Gen B ® Protein 2
• These 1 Gen ® 1 Protein ist falsch!
• ausserem: viele Proteome innerhalb eines Organismus
• verschiedene Expressionen in verschiedenen Zellen
• verschiedene Modifikationen in verschiedenen Zellen
• wissenswerte Daten
• 1 Zelle @ 20 fmol
• 1 Zelle @ 1 Mrd. Proteinmoleküle
• 1 Zelle @ 20.000 verschiedene Proteine
• Protein-Lebenszeit ca. 1min bis Monate
• Feststellung: allein die Falsche Lokation eines Proteins kann zu Erkrankungen führen
• hoher Anteil an Multiproteinkomplexen
• ca. 84% bei der Bäckerhefe
• 3 Typen
• Elisa-Typ
• Chip mit Antikörpern
• Proteine können daran binden
• Nachweis über zweiten Antikörper...
• "Sandwich-Elisa"
• speziesspezifisch
• und sekundärem Antikörper
• Fluoreszenzmarkiert
• messbar
• Protein-Arrays gekoppelt mit Massenspektrometrie
• "MALDI"/"SELDI"
• Anfertigen von Proteinchips
• Massensprektrometrie
• Proteinchips mit gebundenem Proteinlysat wird mit Laser "beschossen"
• Ionisation der Proteine
• Beschleunigung im elektrischen Feld
• Messung der Masse über Flugdauer der Proteine
• TOF: time of flight
• große (schwere) fliegen langsam
• kleine fliegen schnell
• ausserdem: Messung der Trefferzahl (Intensität)
• ® Umrechnung in Molekulargewichte und Konzentrationen
• Auswertung durch Vergleich von Proben von
• normalem Gewebe und
• erkranktem Gewebe
• Tissue-Arrays
• was kann man damit machen?
• Hauptinteresse gilt der Tumorgenetik
• Vorgehensweisen:
• Auswahl der Patientenproben, Klassifizierung der Tumoren
• Herstellen von Kryostatschnitten
• Schockfrosten
• Schneiden
• Laserbasierte Mikrodissektion
• bei DNA/RNA
• Isolation der RNA
• Analyse auf
• DNA-Arrays
• Auswertung
• Analyse der differentiell exprimierten Gene mit realtime QPCR
• bei Proteinen
• Isolation der Proteine
• Analyse auf Protein-Chip
• bioinformatische Auswertung
• Identifikation differentiell exprimierter Proteine
• Clusteranalyse
• Versuch die Gene zu finden, die in einem spezifischen Gewebe stärker/schwächer exprimiert werden
• Hindernisse und Grenzen
• Reproduzierbarkeit?
• Probenmanagement
• Abnahme
• Handling
• Mikrosezierung
• Annotation
• Prae-Hybridisierung
• Markierung
• Hybridisierung
• Auslesen
• Bioinformatik
• Abgleich mit medizinischen Daten
• Perspektiven
• Kosten werden ähnlich wie beim PC sinken
• Sprung in Arztpraxen durch Vollautomatisierung
• Screening auf algemeine Tumor-/Endzündungsparameter
• Spezialisierung auf Verhalten spezieller Tumore
• Therapiebestimmung
• "Point of Care"-Diagnostik
< Präsentation